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            2020-05-26瀏覽量:1196

            『銳翌成果展』母體攝入三氯蔗糖會改變子代腸道菌群,并加劇成年期肝脂肪變性

            銳翌基因協助天津醫科大學總醫院在《Gut Microbes》發表了《Maternal sucralose intake alters gut microbiota of offspring and exacerbates hepatic steatosis in adulthood》,其中16S rRNA基因測序由銳翌基因完成。

             

             

            導讀

            非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是最常見的慢性肝病之一,被認為與飲食和腸道菌群失調有關。三氯蔗糖是一種有機氯人工甜味劑,它被越來越多地添加到日常食用的食品中,如軟飲料、谷類食品和無糖甜點。然而,越來越多的證據表明,過量的三氯蔗糖可引起腸道菌群失調,對宿主健康產生不利影響。而母體的飲食決定了新生兒的微生物群落,這種影響在子代的生活中還會繼續。本研究旨在探討母體攝入三氯蔗糖(maternal sucralose,MS)對子代成年期肝脂肪變性易感性的影響。

             

             

            文獻ID

            英文題目:Maternal sucralose intake alters gut microbiota of offspring and exacerbates hepatic steatosis in adulthood

            中文題目:母體攝入三氯蔗糖會改變子代腸道菌群,并加劇成年期肝脂肪變性

            發表期刊:《Gut Microbes》      IF:7.823

            發表時間:2020/3/31

            通訊作者:王邦茂、曹海龍

            通訊單位:天津醫科大學總醫院

             

             

            材料與方法

            將C57BL/6孕鼠隨機分為MS組(妊娠期和哺乳期攝入MS)和母系對照組(MC組)。斷奶后,所有的幼仔在8周齡之前都以標準飲食喂養,然后用高脂飲食(HFD)喂養4周。對3周齡的幼鼠進行腸道發育、粘膜屏障功能和腸道菌群的檢測。此外,在第12周評估肝脂肪變性的嚴重程度、血清生化、脂質代謝和腸道微生物組成等。

            圖1a 實驗流程圖

             

             

            研究成果

            1、MS抑制3周齡幼鼠的腸道發育,破壞腸道屏障

            在本研究中,幼鼠的性別比例和總產仔數在MS組和MC組之間沒有顯著差異,且兩組均未發現死亡。除MS組子代在2~4周齡時體重明顯高于MC組外,其余8周齡測定時間點兩組子代體重基本一致。但在HFD 15天后,MS組子代體重明顯高于MC組。因此,補充MS可輕微增加斷奶期子代體重,顯著加重HFD幼鼠的體重(圖1b)。

             

            在小鼠出生后第三周之前,胃腸道的發育主要受母體營養的影響。本文研究了三氯蔗糖對3周齡幼鼠腸道發育和腸道屏障完整性的影響。MS組3周齡幼鼠的絨毛長度和隱窩深度明顯小于MC組(圖1c-d)。與MC組比較,MS組Ki67陽性增殖細胞數減少(圖2a)。同時,高碘酸希夫(PAS)陽性細胞(杯狀細胞)數量也減少(圖2b)。MUC2是杯狀細胞最重要的產物之一,與黏液層的形成密切相關。根據MUC2陽性細胞的數量和mRNA的表達,與MC組相比,MUC2的表達量下調(圖2c-d)。緊密連接蛋白包括ZO-1、Claudin-1、Claudin-3和Occludin被認為是決定腸道屏障完整性的最重要因素。PCR數據顯示,MS組Claudin-1、Claudin-3、ZO-1表達明顯降低,Occludin表達與MS組相似(圖3a)。此外,免疫熒光也提示MS組中ZO-1蛋白表達下降(圖3b)。免疫球蛋白A(IgA)在腸道免疫屏障功能中起著關鍵作用,可以抑制病原體的粘附。IgA免疫熒光顯示,MS可顯著降低IgA在小腸的表達水平(圖3c-d),提示MS可抑制幼鼠早期腸道發育,破壞腸道屏障的完整性。

             

            通過H&E染色發現,兩組幼鼠小腸和結腸沒有明顯的炎癥反應(圖1c)。進一步評估促炎細胞因子的水平,包括IL-1β,IFN-γ和結腸組織TNF-α。發現MS 組中這些促炎細胞因子mRNA 表達水平明顯高于MC組(圖2e)。結果表明,攝入MS可引起子代腸道輕度炎癥,損傷腸道屏障功能。

             

            圖1b-d 母鼠攝入三氯蔗糖抑制了3周齡幼鼠的腸道發育

             

            圖2 母鼠攝入三氯蔗糖擾亂幼鼠腸道增殖和分化,并誘發3周齡幼鼠結腸輕度炎癥

             

            圖3 母鼠攝入三氯蔗糖破壞幼鼠結腸的緊密連接,并使3周齡幼鼠小腸IgA減少

             

            2、MS改變了3周齡幼鼠腸道微生物組成

            通過16s rRNA測序對3周齡子代腸道菌群組成和結構進行分析。Venn圖顯示,MC組共356個OTU,MS組共281個OTU,兩組共同擁有268個OTU(圖4a)。分析兩組的微生物群落結構發現,門水平優勢物種分別是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。MS組疣微菌門和變形菌門的相對豐度隨著擬桿菌門的減少而升高。在屬水平,MS組與MC組之間存在顯著差異的屬主要有:Akkermansia、Alistipes、Barnesiella、Blautia、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、Paraprevotella、Robinsoniella、Saccharibacteria_genera_inc-ertaesedis、鏈球菌屬(Streptococcus)。與MC相比,MS組Akkermansia、Blautia、棒狀桿菌屬和Robinsoniella顯著增加;同時,Alistipes、Barnesiella、Paraprevotella、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis和鏈球菌屬減少(圖4b)。

             

            通過Shannon和Simpson多樣性指數評估3周齡幼鼠的微生物alpha多樣性。MS顯著降低了alpha多樣性(圖4c)。通過主坐標(PCoA)分析和Adonis檢驗對非加權 UniFrac 距離進行計算,計算兩組樣本間的差異。結果表明,MS對3周齡幼鼠的微生物組成有顯著影響(圖4d)。

             

            圖4 母體攝入三氯蔗糖改變了3周齡幼鼠腸道微生物組成

             

            通過LEFSe差異分析兩組細菌在門、綱、目、科、屬水平上的豐度差異(圖5a)。差異物種豐度熱圖如圖5b所示。其中MS組抗炎相關的Alistipes相對豐度較低。Parabacteroides(一種能調節宿主代謝、減輕肥胖和代謝功能障礙的菌屬),在MS組中顯著降低。而與肥胖和代謝紊亂高度相關的Blautia在MS組中顯著升高。此外,在MS組中,疣微菌門的Akkermansia(一種降解黏液的菌)相對豐度增加,這可能是由于3周齡子代黏膜屏障功能的破壞和炎癥反應的增加。與MS組腸道輕度炎癥增加相一致,埃希氏桿菌屬(Escherichia)/志賀氏桿菌(Shigella)和Anaerostipes在炎癥性腸病和代謝紊亂中更為豐富的菌,在MS組中增加。鏈球菌和瘤胃球菌在MS組中減少,以往的研究中發現,這兩種菌與炎癥呈負相關。此外, MS 組產丁酸鹽細菌Saccharibacteria_genera_incertae_sedis,普雷沃氏菌(Prevotellaceae)和Clostridium XlVa顯著減少。這些結果表明,在孕期和哺乳期攝入MS可擾亂子代的腸道微生物組成。

             

            圖5 母鼠攝入三氯蔗糖改變了3周齡幼鼠體內關鍵細菌和SCFAs的產生

             

            3、MS降低了3周齡幼鼠盲腸內短鏈脂肪酸(SCFAs)含量

            碳水化合物細菌發酵可產生醋酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽等腸道SCFAs。已有研究報道腸道屏障功能與腸道SCFAs濃度呈正相關。在本研究中,MS組的丁酸鹽產量明顯低于MC組,乙酸和丙酸鹽產量也有下降的趨勢(圖5c)。上述發現以及上述微生物組成的變化提示,產生SCFAs的細菌數量的減少和丁酸鹽產量的下降可能與MS攝入導致腸道發育的抑制和腸道屏障的破壞有關。

             

            4、MS加重了HFD誘導的成年小鼠肝脂肪變性

            越來越多的研究表明,早期腸道微生物失衡和慢性炎癥可能與成年期的不良后果有關。本文研究了早期攝入MS是否會增加成年期肝脂肪變性的風險??偟膩碚f,MS組肝臟顏色為淡黃色,而MC組肝臟顏色為暗紅色(圖6a)。MS組肝臟及腹部脂肪組織重量較MC組明顯增加(圖6b)。與MC組相比,MS 組丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶顯著增加 。此外,MS組血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平明顯升高(圖6c)。

             

            H&E染色證實,兩組12周齡幼鼠均有明顯的脂肪肝。MS組脂肪變性較嚴重,炎性細胞大量浸潤,出現部分片狀壞死。同時,MS組NAFLD活性評分(NAS)也顯著高于MC組(圖6d)。MS組肝臟的炎性細胞因子IL- 6和TNF-α等也升高(圖6e)。

             

            與MC組相比,MS組Fasn、Acaca等脂肪酸合成基因表達水平升高,膽汁酸合成限制酶Cyp7a1基因被抑制,肝臟中調節膽汁酸合成的關鍵基因shp顯著上調(圖6f)。這些基因表達的改變提示了MS干擾脂肪酸和膽汁酸的生物合成和代謝。

             

            圖6 母體攝入三氯蔗糖會加重12周齡幼鼠HFD誘導的肝脂肪變性

             

            5、HFD加重了成年小鼠的菌群失調

            本文重點研究了HFD 4周后,MS組和MC組腸道菌群變化。MS組共336個OTU, MC組共285個OTU,兩組共同擁有269個OTU(圖7a)。與HFD前相比,兩組中厚壁菌門和變形桿菌門的相對豐度均升高,而擬桿菌門的相對豐度均降低。然而HFD 9周后,MS組變形菌門的豐度比MC組下降得更明顯(圖7b)。

             

            兩組間Shannon和Simpson多樣性指數(alpha多樣性)無顯著差異(圖7c)。在beta多樣性方面,Adonis分析顯示兩組之間存在顯著差異(圖7d)?;谖醇訖郩niFrac距離的3周齡和12周齡子代的PCoA分析顯示,HFD確實部分稀釋了MS驅動的腸道菌群的差異(圖7e)??傊?,本文研究結果表明,HFD嚴重加劇了后代腸道菌群的失調。然而,即使在HFD 4周后,MS組的腸道菌群與MC組仍有部分差異。

             

            圖7 母體攝入三氯蔗糖加重12周齡幼鼠腸道發育不良

             

            6、MS使3周齡幼鼠的GPR43表達量降低

            有報道稱,丁酸鹽可激活G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor, GPCRs),包括在腸上皮細胞和脂肪細胞上表達的GPR41、GPR43和GPR109A。這些GPCRs的激活似乎可以通過多種機制緩解NAFLD的進展。通過免疫組織化學方法檢測3周齡子代結腸中GPR41、GPR43和GPR109A的表達發現,在MS組和MC組中,GPR41、GPR43和GPR109A均在結腸組織中表達。然而,MS組結腸中GPR43的表達明顯低于MC組,并伴有產丁酸鹽細菌和丁酸鹽的減少(圖8a)。Real-time-PCR數據也顯示,3周齡子代結腸組織中GPR43的相對表達量較MC組下降(圖8b)。

             

            7、丁酸梭菌通過體外激活GPR43降低炎性細胞因子的產生

            與對照組相比,丁酸鹽和丁酸梭菌上清液刺激HCT116細胞后,GPR43 mRNA水平分別上調2.2倍和2.8倍,GPR109A mRNA水平分別上調2.9倍和2.1倍,但GPR41 mRNA表達無明顯變化。同時,丁酸梭菌上清液和丁酸鹽分別使TNF-α的表達下降26.3%和36.1%。此外,通過RNA干擾技術研究了丁酸梭菌的抗炎功能是否依賴于GPR43。沉默GPR43抑制了丁酸梭菌介導的TNF-α 表達量下調。在HCT8細胞中也出現了類似的結果(圖8c-g)。這些結果表明,丁酸梭菌通過激活GPR43具有抗炎作用。

             

            圖8 丁酸梭菌通過激活GPR43降低炎性細胞因子的產生

             

             

            研究結論

            1、MS抑制3周齡幼鼠的腸道發育,破壞腸道屏障,導致腸道輕度炎癥。

            2、MS對3周齡幼鼠腸道的微生物組成有顯著影響,且HFD可顯著加重成年小鼠的菌群失調。

            3、MS干擾成年小鼠的脂肪代謝,加重了HFD誘導的肝脂肪變性。

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