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            2019-08-23瀏覽量:1586

            關鴻志 | mNGS技術在診斷中樞神經系統感染中的應用

            導讀

            在今年的6月10日,北京協和醫院神經科關鴻志教授聯合國內多家醫院,在BioRxiv雜志上在線發表一篇多中心研究文章:Metagenomic Next-generation Sequencing of Cerebrospinal Fluid for the Diagnosis of Central Nervous System Infections: A Multicentre Prospective Study。這篇文章的發表預示著國內mNGS技術在中樞神經系統感染的診斷進入了應用階段。

             

            背景 

            傳染性腦炎和腦膜炎是造成神經系統疾病的主要因素。在現有的臨床治療中,這些疾病通常是經驗性治療,很多情況下難以確定其致病原。臨床上會利用傳統診斷技術來檢測致病原,可結果只有50-80%的患病者到夠檢測出致病原。因此,傳統檢測方法帶來的不確定性,常常造成病人的治療延誤、不充分和不適當。

             

            早在2013年,美國Charles Chiu教授首次應用病原宏基因組(mNGS)技術,診斷出14歲小男孩因鉤端螺旋體感染致腦病,且挽救了他的生命。在這之后,這項技術引起了全球神經科醫生的極大興趣.。

             

            mNGS是一種高通量測序技術,它可以同時對成千上萬到數十億個DNA或RNA片段進行獨立測序。和傳統檢測方法相比,mNGS無需輸入臨床預測因子或其他實驗室結果,即可識別病原體。又因腦脊液(CSF)在健康人群中通常是無菌狀態,所以神經科醫生認為,在診斷中樞神經系統(CNS)感染中,使用CSF樣本非常契合這項新技術的應用。

             

            在這樣的臨床和技術背景下,關教授和其研究團隊進行了一項多中心前瞻性研究,綜合評價腦脊液 mNGS技術在診斷中樞神經系統(CNS)感染方面的表現,并與傳統微生物學方法進行比較。

             

             什么樣的病人使用了這項技術?

            在長達1年的研究時間里,關教授及其研究團隊共納入來自中國20家醫院的276例腦炎或腦膜炎患者。他們先從287例患者中排除了11例系統性血管炎、自身免疫性腦炎、原發性中樞神經系統淋巴瘤等非感染性疾病的患者,剩下的276例為符合以下標準的成年患者(表1):

             

            主要標準(必選): 

            患者就診時出現無明確病因導致的超過24小時的精神狀態改變(意識水平降低或改變,或者人格改變),且/或全身性或部分性癲癇(但并非完全歸因于先前的癲癇癥或單純的發燒性癲癇)。

             

            次要標準(≥ 2條):

            1. 癥狀出現前或出現后72小時內發熱≥38℃

            2. 新發局灶性神經系統發作

            3. 腦脊液白細胞計數≥5/立方毫米

            4. 影像學上腦實質異常,提示腦炎

            5. 腦電圖異常與腦炎癥狀一致,且不能明確此癥狀病因

             

            表 1

             

            這276例腦脊液標本均使用mNGS技術檢測,以傳統檢測方法為金標準,根據相關指南和共識,將mNGS的結果分為真陽性、假陽性和假陰性。

             

            什么樣的標準提示mNGS結果是真陽性的?

             

            為了減少腦脊液樣本受污染的影響,團隊將檢測到的種特異性序列數(SSRN)標準化至20M,并采用以下標準來判定mNGS的結果為陽性:

             

            1) 對于細胞外細菌、真菌(隱球菌除外)和寄生蟲,如果檢測到的SSRN≥30(RPM≥1.50),在陰性對照中未出現且該讀數在細菌、真菌或寄生蟲中排名前10位,或者在陰性對照中出現,檢出序列數是陰性對照的10倍且在過去一個月內未多次出現(多次判斷標準>25%),則樣本結果為陽性;

             

            2) 對于胞內細菌(不包括結核分枝桿菌和布魯氏桿菌)和隱球菌,如果檢測到的SSRN≥10(RPM≥0.50),在陰性對照中未出現且該讀數在細菌、真菌中排名前10位,或者在陰性對照中出現,檢出序列數是陰性對照的10倍且在過去一個月內未多次出現(多次判斷標準為>25%)則樣本結果為陽性; 

             

            3) 對于病毒、布魯氏桿菌和結核分枝桿菌,如果檢測到的SSRN≥3(RPM≥0.15),則認為結果為陽性。

             

            有了標準后,真實檢測結果如何?

             

            總共276位患者的檢測結果中,其中mNGS檢測到陽性結果122例(假陽性12例),傳統檢測方法檢測到陽性結果126例,且其中114例是“致病原”(表2)。

             

            因此mNGS檢測出真陽性結果為101例,陽性率為36.60%。所有mNGS結果均在不到48小時內獲得,并且其速度快于任何傳統檢測方法。

             

             表 2

             

            在首次被mNGS診斷的患者中,16.3%的感染是由細菌引起的,15.2%是由病毒引起的,2.9%是由真菌引起的,2.2%是由寄生蟲引起的(圖A)。

             

            圖 A

             

            mNGS真陽性的結果細節如下(圖B):  

             

            11種細菌,其中常見的是結核分枝桿菌(14例,13.9%)和單核細胞增生李斯特菌(8例,7.9%);

            7種病毒(BK多瘤病毒不是致病病原體),其中常見的是水痘帶狀皰疹病毒VZV(17例,16.8%)和單純皰疹病毒1型 HSV1(12例,11.9%);

            2種真菌,其中兩種都是隱球菌(8例,7.9%);

            2種寄生蟲,其中豬肉絳蟲(5例,5.0%)是最常見的。

             

            圖 B

             

             如何理解假陽性、假陰性結果?

             

            假陽性:12例(4.3%)患者出現假陽性,主要與細菌感染有關(n = 12;表2),包括大腸桿菌、屎腸球菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽糖桿菌和銅綠假單胞菌,也有過布魯氏菌的假陽性。

             

            根據先前提出的標準,病毒、真菌或寄生蟲沒有假陽性。雖然人類皰疹病毒4型(EBV)在大多數病例中不是致病病原體,但在部分患者的腦脊液中存在。此外,大部分腦脊液樣本都有一些背景污染(表2),但這些結果不符合陽性結果的標準。

             

            觀察到的各種類型污染可分為兩組:(1)通常與背景污染相關的微生物,不符合陽性結果的標準(表2)和(2)滿足mNGS陽性標準的假陽性結果,但與患者的臨床表現和特征不一致。

             

            作者后來又提出,污染主要來自以下來源:

            (1)實驗室操作(細小病毒NIH CQV是硅柱狀核酸提取試劑盒中的一種污染物);

            (2)試劑(緩生根瘤菌、伯克霍爾德菌和拉爾斯頓菌是工業超純水系統中常用的污染物);

            (3)環境(大腸桿菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌和扭矩病毒是醫院環境中廣泛存在的病原體);

            (4)皮膚或其他身體菌群(痤瘡丙酸桿菌、大腸桿菌和表皮葡萄球菌與人類皮膚菌群相關)。

             

            假陽性結果很可能誤導治療,因此,臨床醫生應意識到這些在醫院環境中普遍存在的細菌或真菌,在對待此類陽性mNGS結果時應該謹慎,特別是在單純使用mNGS檢測的情況下。另一方面,病毒和寄生蟲的陽性mNGS檢測不太可能是假陽性。

             

            假陰性:16例(5.8%)患者出現假陰性(表2),結果顯示與細菌、病毒和真菌感染有關。假陰性細菌感染病例均在測序前給予抗生素治療。在病毒感染的假陰性病例中,SSRN數量為1或2個,這不滿足之前mNGS陽性的建議標準。

             

            如果將陽性結果的標準放寬到SSRN≥1 (RPM≥0.05),則無單純皰疹病毒1型(HSV1)或水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的假陰性,或HSV1、HSV2、VZV假陽性的病例。如果對病毒和結核分枝桿菌采用SSRN≥1(RPM≥0.05)的替代標準,可能會出現更多的假陽性,包括30例EBV、7例CMV(巨細胞病毒)和5例結核分枝桿菌感染。因此需要指出的是,這5例結核分枝桿菌感染的可能性不能從臨床表現上排除,傳統檢測方法可能無法檢測到結核分枝桿菌。

             

            通過假陰性概率可以看出,患者如在檢測前使用抗生素會影響細菌的檢出率。在病毒檢測的假陰性結果中可以看到低SSRN值(1或2個讀數),表明當病毒SSRN指數低時,應該進行其他測試以確認診斷。因此作為篩選方法,mNGS檢測到的病原體可為進一步診斷提供臨床線索,即使結果不符合陽性結果的標準。

             

             mNGS技術在臨床的應用如何影響醫生的診斷?

             

            作者根據實驗結果,提出腦脊液mNGS在本研究的臨床環境應用中,可以被認為是用于診斷CNS傳染病的準一線方法。

             

            mNGS測序技術,不僅可以檢測預期之外的新微生物,更重要的是,mNGS可以檢測到臨床醫生可能因非典型臨床表現而未考慮到的病原體。此外,腦脊液mNGS不僅具有鑒定CNS感染新病因的能力,還可以檢測到可能指導適當靶向治療的意外共感染。最后,腦脊液mNGS可能是在對自身免疫性疾病的最終診斷之前,排除廣譜潛在CNS傳染病的適當工具。

             

            關教授的研究中,超過三分之一的患者在48小時內首次通過腦脊液mNGS診斷,表明該技術對于快速臨床決策非常有用。

             

            因此當患者出現以下情況時,腦脊液mNGS測序技術應被視為急性CNS感染的一線檢測:

             

            (1)患者病情危重并需要及時和精確的治療;

            (2)臨床表現是非特異性的,并且聯合其他傳統檢測用于識別致病原;

            (3)需要排除廣泛的潛在病原體以診斷疑似自身免疫性腦炎;

            (4)懷疑罕見或新型病原體且無法通過傳統檢測方法查出致病原。

             

             局限

            目前在臨床環境中使用mNGS技術存在一些限制。首先,許多醫院都沒有現有的檢測儀器,而且此類檢測成本通常遠高于其他傳統檢測方法。 其次,檢測出某種病原體的DNA并不一定證明它就是患者的實際致病原。最后,mNGS無法檢測出數據庫中未包含的微生物。例如在關教授的本次研究中,實驗設計未構建RNA文庫,因此未能檢測到RNA病毒。

             

            結語 

            腦脊液mNGS檢測對于疑似中樞神經系統感染患者的診斷評估是非常有用的技術。 mNGS可以成為應對新出現的傳染病和傳染病爆發的一線實驗室方法。若采用嚴格的mNGS陽性結果標準,并使用傳統檢測方法作為金標準,那么mNGS測序技術將會使更多醫生和患者受益其中。


            原文獻ID

            題目:Metagenomic Next-generation Sequencing of Cerebrospinal Fluid for the Diagnosis of Central Nervous System Infections: A Multicentre Prospective Study

            期刊:BioRxiv     

            發表時間:2019年6月

            通訊作者:關鴻志

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